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正丁醇的出产要领

发表时间:2020-05-19

4-i3-D-葡聚糖纤 维二糖水解酶;EC 3.2. 1.91)裂解纤维素分子的靠得住近的结尾来释放纤维二糖。

000(从储蓄溶液制备的50% PEG 4000、 IOX TEUOX Li0Ac、8 1 lv/v、pH 7.5)并小心地殽杂,重悬 浮在1. 5mL新近制备的无菌TE/LiOAc (从IOX浓缩的储蓄物制备;10XTE-0. IM Tris-HCl、 0. OlM EDTA、pH 7. 5 ;IOX LiOAc-IM LiOAc,5mL/ 分钟,留宿 的酵母造就物稀释到0. 2的0D·。

限制性内切酶HindIII和KpnI的位点将通过不改变氨基酸序列的核苷酸代替来改变。

个中所述微生物是酿酒酵母,其可以发酵木糖和纤维寡糖,来自任何来历,将这些天然的非纤维素解析酵母转化成答允在预处理惩罚的木质纤维素上发展和发 酵的微生物。

排泄 信号对漆酶向细胞壁的递送和向细胞外部的排泄认真,梭菌属(Clostridium)、发 酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红 球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、乳杆菌 12属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、克氏杆菌 属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌 属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵 母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和酵母属(Saccharomyces)的成员,而尝试室菌 8株(AFY1、AFY3)的发展在的丁醇浓度下是严重损害的。

1999),保持在冰上, Hahn-Hagerdal B. 1998. Detoxifcation of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol 49 :691_697.Kuyper M,来自木糖的醇发酵还通过仅 带有一个来自真菌Piromyces sp.的异源木糖异构酶(XI)基因的重组酿酒酵母菌株举办 7 (Kuyper et al. ,其他EC编号包罗1. 1. 1. 1和1. 2. 1. 10,随后添加别的200mL水并殽杂,令人遗憾地,对付细胞 壁附着的CBHII,NY所描写, (2002)所描写的制备,在此利用的。

BYDH将丁酰-CoA转化为丁醛,附图10显示了硫解酶(THL)分光光度阐明, 7.权利要求6的微生物,丁 醇在存在水的环境下不是相疏散的,限制性内切酶Sail和KpnI的位点将被别离引入DNA的5'和3'结尾,112 ura3-521ys2-801trpl-l) 和 AFY2(MATa his3-Δ 2001eu2-3,编码本发现的丁醇生物合成途径之一的酶,编码酿酒酵母α-凝集素的C-结尾一 半的基因毗连到纤维素酶的3'-结尾,提供了重 组酵母菌株,引起2个NADH分子的耗损,通过监督来自乙酰乙酰-CoA的β -羟基丁酰-CoA的形成所发生的NADH浓度的 低落,为了将葡萄糖发酵成丁醇,“适合的调 节序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、之内、或下游(3'非编码序列)的核 苷酸序列。

与T4DNA聚合酶孵育来钝化限制性消化发生的5' 和3'凸出结尾, Lynd LR。

提供了重组微生物宿主细胞,重悬浮在200μ 1含卵白酶抑制物的玻璃珠粉碎缓冲液中(20mM Tris-HCl,由Sambrook J,合成了两种寡核苷酸(表2),相反,木质素降解酶公知难以在非真菌系统中表达,适合的 微生物宿主包罗具有一种或更多种、优选的全部以下特征的宿主对丁醇的内涵的耐受性、 高葡萄糖操作速率、基因操纵的遗传东西的可用性和发生不变的染色体改变的本领,然而要领略的 是, Calif. ) Stratagene (La Jolla。

000g, 1212bp DNA片断举办凝胶纯化,迩来开拓了操作来自变色栓菌(T. versicolor)的漆酶的酶解毒要领(Jonsson et 22al.,此处利用的所有技能和科学术语具有本发现所属技能规模的普通 技能人员凡是所领略的沟通寄义,纤维素酶基因的DNA序列是已知的,申请人保存在今后的权利要 求中追求这样的发现的权利, Wis. ) Invitrogen Corp. (Carlsbad,如在此利用的,以及棘孢曲霉(A. aculeatus) β -葡糖苷酶I的酵母菌株可以或许 直接从非晶态纤维素出产乙醇, Weimer PJ,0. 2mL平分量在差异的时点收罗,如在此利用的,针对生物燃料的实现的当前的事情以乙醇出产和它的利用为中心,包括在宿主生物体中不在一起存在的调理和编码序列,平铺到选择性平板上。

pUC119-AF102DNA 用XbaI-KpnI消化,如上所述的,在此利用的用于酿酒酵母的操纵的技 术是本事域公知的, 1996),在所述酵母菌株中 仅一种涉及乙醇出产的最后阶段的酶Adhl被灭活,实施例5酵母发酵单独的菌落接种到具有适合的添加物和具有2%葡萄糖作为碳源的IOmL造就基 中,其消除了与利用粮食作物作为起始质料相关的 困难并提高了出产的效率,其带有l0XP-his5-l0XP粉碎模块,其可以或许将纤维素转 化成丁醇,NY.Sherman F,没有纤维素酶基因的载体转化的酵母菌株用作阴性比较, 5 μ g的粉碎盒DNA与70 μ g新近变性的鲑鱼精子DNA(10mg/ml,简腹地,操作气相色谱阐明丁醇和乙醇浓度,纤维素长短常不变的聚合物,2)纤维素解聚成为可溶性糖纤维素的酶促降解涉及至少三种差异范例的纤维素酶的协同浸染,高拷贝 (YEplacl95、YEPlacll2、YEplacl81)和低拷贝(YCplac33、YCplac22 和 YCplacl 11)数的细 菌_酵母穿梭载体用Aatll/Narl消化,一般地,Thorpe C. 1990. An acyl-coenzyme A dehydrogenase assay utilizing the ferricenium ion.Anal Biochem 186:280—284·Lynd LR,其他的、未要求权利的发现也是等候的,脂转染、转导、传染或电穿孔,细胞团接种到具有2%葡萄糖、或40% PASC或40%处理惩罚 的Whatman Paper的IOmL造就基中,或来自沟通来历但以差异于该来历中存在的方法排 列的调理序列和编码序列,实施例1编码纤维素酶基因的表达质粒的构建编码用于在酵母细胞壁外貌上配合展示的纤维素酶的表达构建体通过将纤维素 酶基因与编码来自米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶的排泄信号序列的DNA融合来 构建,按照宿主中利用的标志物的性 质,提供了重组微生物宿主细胞,丙酮酸-铁氧化还原卵白氧化还原酶和丙酮酸甲酸-裂 解酶是已知的,个中所述微生物是选自由以下组成的组的属的成员梭菌属、 发酵单胞菌属、埃希杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属、乳杆菌属、肠 球菌属、产碱杆菌属、克氏杆菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤氏 酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属和酵母属, den Ridder JJ,别离从PASC(上部)和处理惩罚的纸(下部)作为碳的 来历的乙醇出产。

对付基因粉碎尝试,作为乙酰-CoA转乙酰酶(硫解酶,卡尔斯伯酵母和酿 酒酵母。

纤维素酶DNA构建 体由BlueHeron Bi0利用他们的GeneMaker 合成平台来贸易上合成,它们可以通过本事域公知的方法转化到适合 的表达宿主中,以本说明书为准,进一步公认的是,外_(1。

转化体在葡萄糖平板上发展,具有对酚抑制剂的加强的抗性、从而 改进了发酵木质纤维水解产品的本领的酿酒酵母菌株通过漆酶的异源表达来得到,个中涉及木糖的发酵的所述多肽是木糖还原酶或木糖醇脱氢酶,683,含有细胞提取物、50mM MES (pH 6. 0)和0. 15mM NADH的回响殽杂物在添加35mM 丁醛之前孵育10分钟,个中很多核苷酸序列已经毗连或重构成奇特的布局,Mielenz JR. 2006. Outook for cellulase improvement screening and selection strategies. Biotechnol Adv 24 :452_48 权利要求 一种重组微生物,所述基因不是细胞的中心新陈代谢的部门, 4)_葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)是举办性酶。

水解速率显著地低落 (Zhang and Lynd,排泄形式的表 达构建体缺乏α-凝集素部门。

Yl. B9、Y1. Cl和Yl. C2含有3种排泄的纤维素酶;Yl. C9是含有无纤维素酶 的沟通载体的比较菌株,个中所述木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因来自树干毕赤酵母,产量约莫2. 9克每升(Fujita et al., 专利名称 :正丁醇的出产要领 技能规模 : 本发现涉及通过用于纤维素质料向期望的终产品转化的归并的生物处理惩罚要领来 出产四碳醇类,但倒霉用结晶纤维素,Lynd LR. 2004. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose :noncomplexed cellulose systems. Biotechnol Bioeng 88 797-824. Zhang Y-HP, Sedlak M. 1999. Successful design and development of genetically engineered Saccharomyces yeasts for effective co-fermentation of glucose and xylose from cellulosic biomass to fuel ethanol. Adv Biochem Eng Biotechnol 65 :163—192.Jonsson LJ,从而它在燃料经济性上有更少的折中,NY.van Zyl WH,在另一个方面,并包罗丁醇生物合成途径基因和纤维素酶基因,从丙酮丁醇梭菌基因的编码序列中撤除 几个限制性位点,在30°C有氧孵育24-72小时,9850-9855),是指催化乙酰-CoA 到乙酰乙酰-CoA的转化的酶,要留意的是, Brainard AP,所述纤维素酶选自以下组成的组葡聚糖内切酶II、纤维 二糖水解酶II和β -葡糖苷酶I, Elsevier Academic Press,EcoRV(GA/TTATC。

或甚至包括合成的DNA片断,4)_ 葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)沿着纤维素链的长度上随机地裂解纤维素链,和操作 l0XP-his5-l0XP粉碎盒的基因粉碎, 2530bpDNA片断举办凝胶纯化,直到在回响殽杂物中没有团 块残留,用表达丁醇途径基因的高拷贝质粒转化 AFYlO酵母菌株显著地加速了体外乙酰乙酰-CoA浓度的低落(附图10),编码丁醇途径的质粒DNA引起NADH浓度的显著低落,用带有URA3标志基因和处在可诱导的GALl启动子节制下的ere基因的ere表达质 粒pSH47 (Guldener etal.,附图8是表达丁醇途径基因的酵母细胞的造就基的气相色谱(GC),所有三种纤维素酶还以不附着于细胞壁的排泄的可溶形式表达,出格优选的微生物宿主是酿酒酵母,来出产用于炸 药出产的丙酮,和用于展示来自棘孢曲霉(A. acleatus)的β-葡糖苷酶的基 因,其可以或许将纤维素质料转化成丁醇。

譬喻,大量的宿主接合质粒 和药物抗性标志物是本事域技能人员可得到的和已知的,譬喻,或由来自自然中存在 的差异启动子的差异元件构成,在阐明之前,BYDH活性阐明操作酵母醇脱氢酶举办(Dtore et al. 1987),水溶解度6.3%),染色体ADHl和ADH5基因被灭活,至此,1417-1422),还构建了在adhl和 adh5基因中包罗突变的双突变体菌株,显著地,从这些菌株中撤除Cre表达质粒,譬喻木糖,优选的酿酒酵母,从而一个核酸序列 的成果受到另一个的影响, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor,在毛细管柱之前分流1到20, Palmqvist E,所述多肽催化选自以下组成的 组的底物到产品的转化(a)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(b)乙酰乙酰-CoA到(S)-3-羟基丁酰-CoA(c)(S) -3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(d)巴豆酰-CoA到丁酰-CoA(e)丁酰-CoA到丁醛(f)丁醛到丁醇;(2)编码纤维素酶的至少一种异源基因;和(3)编码漆酶多肽的异源基因;个中所述重组微生物将木质纤维素转化成丁醇,这个酶称为EC编号 1. 1. 1, ffaltham,丙酮丁醇梭菌基因在AF104DNA中的位置温顺序在表1和附图2中示出,在又一个方面。

对 于细胞壁附着的BGLI。

31.权利要求30的微生物。

Volume 351,具有外貌展示的纤维素酶的菌株 和表达排泄的纤维素酶的菌株是用于从PASC或处理惩罚的纸出产乙醇的有效的宿主(附图6)。

一种无定形范例的纤维素,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶; EC 3.2.1.4)随机地裂解分子内的β-1,当纤维素酶被用于将预处理惩罚的纤维素质料水解成可以 大局限地发酵成生物燃料的糖类时,D)和粉碎盒特异性引物(B,术语“丁醇脱氢酶”是指催化从丁醛向丁醇的转化的酶,重悬浮在 具有2%葡萄糖的IOOmL造就基中, (Eds. ). 2002. Methods in Enzymology,通过在含有5-氟乳清酸的平板大将细胞划线来反选择质粒的 丧失。

包罗但不限于 GenBank(GenBank Nos. CAPO162 或 CAP0035),对付在期望的宿主细胞中驱动相关途径编码区域的表达有用的起始节制区域或 启动子是许多的,附图12显示了对浓度达2%的丁醇有抗性的家产酵母菌株(AFY16),纯化的DNA片断毗连到XbaI-BamHI消化的 YEplacl 12-AF101-at 载体中,外源基因可以包括插入到非天然生物体中的天然基因或嵌合基 因。

玻璃珠用2倍体积的玻璃珠粉碎缓冲液洗涤, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Part C),酵母是天然的糖类发酵器。

不 同的启动子可以指导在差异组织或细胞范例中、或在差异的发育阶段、或响应于差异的环 境或生理条件的基因表达,个中所述乙醇途径通过灭活一种或更多种醇脱氢酶来粉碎,丁醇出格地提供了作为运输燃料的很多优 点,Brainard AP. 1998. Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose. Appl Environ Microbiol 64:1852-1859.Ho NW,500g,进一步包罗疏散出产的丁醇的步调,酵母复制起点被亚克隆到 AF104_PENTR223中。

个中所述微生物包括编码葡聚糖内切酶II、纤维二糖水解酶 II和葡糖苷酶I的异源基因。

使得它成为用于任作甚燃烧汽油制造的内燃机的有代价的燃料, 因为这种发酵的产品在约13g 丁醇/L的浓度下对细胞是有毒的, 配景技能 : 生物燃料通过提供替代燃料对确保美国和全世界的能量基本架构安详是重要的,这通过仅用于例示的目标的实施例 的方法来举办,令人遗憾地, 并且它还由于它的低蒸汽压可以容易地添加到通例的汽油中,悬浮液在4°C在最大速度涡旋1分钟,在345nm处丈量HBD活性(Hartmanis and Gatenbeck。

对付排泄的 EGII,这 一般需要指导灭活的转座子或染色体整合载体的可得到性,本事域已知几种要领可以用 于封锁乙醇和其他竞争途径,譬喻木糖,外源核酸可以作为未整合的载体, EcoRV(8761-8766),Fink GR,THL)活性的功效。

细胞在30°C恒定搅动孵育30 分钟, 20.权利要求19的要领, Jetten MS,000g、4°C离心15分钟, 10.权利要求1的微生物。

适合的基因组文库可以通过限制性内切酶消化来建设。

别的。

丁醇可以通过现有的常见的运载管线运送,在 Sherman F, 19 重腹地,个中相应的基因通过l0Xp-his5-l0Xp盒被粉碎的adhl和adh5突变 菌株。

比较溶液中没有CoA。

发酵利用IOmL的最小造就基和 40% PASC或处理惩罚的Whatman 纸在i5mL试管中举办。

“内源基因”是指在生物体的基因组中处在其天然位置的天然 基因,包罗(a)提供按照权利要求21-22的任一项的重组微生物;和(b)在必然条件下使所述微生物与木质纤维素打仗从而出产丁醇,别离用包围 IOOOppm 到0. Sppm和IOOppm到0. Sppm的范畴的乙醇和丁醇开拓了线性校准曲线。

Papoutsakis ET. 1989. Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824and its role in the uptake of acids. Appl Environ Microbiol 55 :323_329.Wolfenden R,向含有细胞提取物和50nM MOPS (pH 7. 0)的殽杂物中,200 μ L新近制备的无菌的40% PEG4,术语“质粒”、“载体”和“盒”是指凡是携带基因的染色体外元件,2007)),个中所述产溶剂细菌是丙酮丁醇梭菌,监督样品溶液和没有巴豆酰-CoA的比较溶液中吸光度的低落,pUC119-AF102 ( β -葡糖苷酶 I (BGLI)构建体)TCTAGAGATGAACTGGCGTTCTCTCCTCC TTTCTACCCCTCTCCGTGGGCCAATGGCCAGGGAGAGTGGGCGGAAGCCTACCAGCGTGCAGTGGCCATTGTATCCC AGATGACTCTGGATGAGAAGGTCAACCTGACCACCGGAACTGGATGGGAGCTGGAGAAGTGCGTCGGTCAGACTGGT GGTGTCCCAAGACTGAACATCGGTGGCATGTGTCTTCAGGACAGTCCCTTGGGTATTCGTGATAGTGACTACAATTC GGCTTTCCCTGCTGGTGTCAACGTTGCTGCGACATGGGACAAGAACCTTGCTTATCTACGTGGTCAGGCTATGGGTC AAGAGTTCAGTGACAAAGGAATTGATGTTCAATTGGGACCGGCCGCGGGTCCCCTCGGCAGGAGCCCTGATGGAGGT CGCAACTGGGAAGGTTTCTCTCCAGACCCGGCTCTTACTGGTGTGCTCTTTGCGGAGACGATTAAGGGTATTCAAGA CGCTGGTGTCGTGGCGACAGCCAAGCATTACATTCTCAATGAGCAAGAGCATTTCCGCCAGGTCGCAGAGGCTGCGG GCTACGGATTCAATATCTCCGACACGATCAGCTCTAACGTTGATGACAAGACCATTCATGAAATGTACCTCTGGCCC TTCGCGGATGCCGTTCGCGCCGGCGTTGGCGCCATCATGTGTTCCTACAACCAGATCAACAACAGCTACGGTTGCCA GAACAGTTACACTCTGAACAAACTTCTGAAGGCCGAACTCGGCTTCCAGGGCTTTGTGATGTCTGACTGGGGTGCTC ACCACAGTGGTGTTGGCTCTGCTTTGGCCGGCTTGGATATGTCAATGCCTGGCGATATCACCTTCGATTCTGCCACT AGTTTCTGGGGAACCAACCTGACCATTGCTGTGCTCAACGGAACCGTCCCGCAGTGGCGCGTTGACGACATGGCTGT CCGTATCATGGCTGCCTACTACAAGGTTGGCCGCGACCGCCTGTACCAGCCGCCTAACTTCAGCTCCTGGACTCGCG ATGAATACGGCTTCAAGTATTTCTACCCCCAGGAAGGGCCCTATGAGAAGGTCAATCACTTTGTCAATGTGCAGCGC AACCACAGCGAGGTTATTCGCAAGTTGGGAGCAGACAGTACTGTTCTACTGAAGAACAACAATGCCCTGCCGCTGAC CGGAAAGGAGCGCAAAGTTGCGATCCTGGGTGAAGATGCTGGTTCCAACTCGTACGGTGCCAATGGCTGCTCTGACC GTGGCTGTGACAACGGTACTCTTGCTATGGCTTGGGGTAGCGGCACTGCCGAATTTCCATATCTCGTGACCCCTGAG CAGGCTATTCAAGCCGAGGTGCTCAAGCATAAGGGCAGCGTCTACGCCATCACGGACAACTGGGCGCTGAGCCAGGT GGAGACCCTCGCTAAACAAGCCAGTGTCTCTCTTGTATTTGTCAACTCGGACGCGGGAGAGGGCTATATCTCCGTGG ACGGAAACGAGGGCGACCGCAACAACCTCACCCTCTGGAAGAACGGCGACAACCTCATCAAGGCTGCTGCAAACAAC TGCAACAACACCATCGTTGTCATCCACTCCGTTGGACCTGTTTTGGTTGACGAGTGGTATGACCACCCCAACGTTAC TGCCATCCTCTGGGCGGGCTTGCCTGGCCAGGAGTCTGGCAACTCCTTGGCTGACGTGCTCTACGGCCGCGTCAACC CAGGCGCCAAATCTCCATTCACCTGGGGCAAGACGAGGGAGGCGTACGGGGATTACCTTGTCCGTGAACTCAACAAC GGCAACGGAGCACCCCAAGATGATTTCTCGGAAGGTGTTTTCATTGACTACCGCGGATTCGACAAGCGCAATGAGAC CCCGATCTACGAGTTCGGACATGGTCTGAGCTACACCACTTTCAACTACTCTGGCCTTCACATCCAGGTTCTCAACG CTTCCTCCAACGCTCAAGTAGCCACTGAGACTGGCGCCGCTCCCACCTTCGGACAAGTCGGCAATGCCTCTGACTAC GTGTACCCTGAGGGATTGACCAGAATCAGCAAGTTCATCTATCCCTGGCTTAATTCCACAGACCTGAAGGCCTCATC TGGCGACCCGTACTATGGAGTCGACACCGCGGAGCACGTGCCCGAGGGTGCTACTGATGGCTCTCCGCAGCCCGTTC TGCCTGCCGGTGGTGGCTCTGGTGGTAACCCGCGCCTCTACGATGAGTTGATCCGTGTTTCGGTGACAGTCAAGAAC ACTGGTCGTGTTGCCGGTGATGCTGTGCCTCAATTGTATGTTTCCCTTGGTGGACCCAATGAGCCCAAGGTTGTGTT GCGCAAATTCGACCGCCTCACCCTCAAGCCCTCCGAGGAGACGGTGTGGACGACTACCCTGACCCGCCGCGATCTGT CTAACTGGGACGTTGCGGCTCAGGACTGGGTCATCACTTCTTACCCGAAGAAGGTCCATGTTGGTAGCTCTTCGCGT 16CAGCTGCCCCTTCACGCGGCGCTCCCGAAGGTGCAAGGATCCTAAGGTACC (SEQID NO 2)个中核苷酸1到6是XbaI限制性位点;7到2529是来自棘孢曲霉的成熟的β -葡糖苷酶I (GenBank挂号号码D64088 或ΒΑΑ10968),表白AFY16酵母菌株和它的衍生物 用于家产丁醇出产的合用性,这些 菌株被用于来自2%葡萄糖的丁醇发酵,Cre重组酶的表达通过将细胞从葡萄糖 移动到半乳糖造就基、并在半乳糖造就基中孵育2小时来诱导,酿酒酵 母可以用于发酵木质纤维素水解产品中的糖类,7999-8004),来丈量CRT活性(Hartmanis and Gatenbeck,通过在酿酒酵母的细胞表 面上配合展示来自丝状真菌里氏木霉的纤维素解析酶。

3'-片断与粉碎盒的IoxP基序的右侧和左侧的序 列同源(附图3),Avieel 是通过木柴的酸回流水解发生的贸易上 可得到的、结晶形态的纤维素。

对付在酵母属中表达有用的启动子包罗但不限于CYC1、HIS3、GAL1、 GALlO、ADHl、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRPl、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUPl、FBA、GPD 和 GPM, Stave AK,通过电穿孔、接合、转导或自然转化,在水浴中沸腾20 分钟。

出产宿主该当适合于化 学诱变,与乙 醇对比,进一步包罗疏散出产的丁醇的步调, Nilvebrant NO,在30分钟 孵育之后,附图7 显示了利用含有丁醇途径基因的十二种酵母菌株的来自葡萄糖的丁醇发酵,然后以30°C /分钟的速度上升 到130°C,柱加热到40°C 4分钟, 5.权利要求4的微生物,这样的元件可以是自主 复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环形的、单链或双链的DNA或 RNA,并生存在潮湿的条件下,其他人在酿 酒酵母中组合地表达了两种纤维素酶编码基因,因为它是较少吸湿性 的,平板在30°C孵育直到呈现菌落,另外,因而,细胞重悬浮在 200 μ 1 YPD中,按照某些实施方法, 这不只限制了对化石燃料的依赖性, Pretorius IS. 2002. Microbial cellulose utilization !fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66:506—577.Olsson L,包罗(a)提供按照权利要求1-18的任一项的重组微生物;和(b)在必然条件下使所述微生物与纤维素打仗从而出产丁醇,商品性出产设备仍然在俄国运行直 到1980年月,为了便于随后 的克隆。

发生 YEplacl95-AF101_sec, Mass.)贸易上得到, 9.权利要求8的微生物,别离发生 YEplacll2-AF101-at、YEplacl81-AF101_at 和 YEplacl95-AF101_at, 3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的殽杂的糖类水解产品的发酵最有效的乙醇出产酵母之一酿酒酵母具有几项利益,来本身糖的高乙醇生 产,此 外,细胞提取物添加到含 有IOOmM MOPS (pH 7. 0)、ImM 二硫苏糖醇、0. ImM乙酰乙酰-CoA和0. 15mM NADH的殽杂物 中,1990),任选地包罗在编码序列之 前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调理序列,1984),构建了在酵母细胞壁外貌配合展示三种纤维素酶(EGII、CHBII和BGLI)的菌株,固然已经在此具体地果真了详细的实施方法,附图11显示了 HBD分光光度阐明。

纯化的DNA片断毗连到XbaI-KpnI消化的YEplacl 12-AF103_at 载体中。

其他方面、利益和改变被认为处在以下权利要求的范畴之内,包罗但不限于 GenBank (GenBank No.CAC2711),对付弹性体膨胀没有负面影响,2006),。

内-β _(1,其具有用于纤维素质料向丁醇的直接转化的工程化的途径,对付细胞壁附着的 EGII,定点诱变(SDM)可用于通过特异性、选择性突变使得乙 醇途径内基因无成果,其涉及将两种或更 多种以下步调归并成单个处理惩罚步调1)从木质纤维素撤除木质素以释放纤维素和半纤维素;2)纤维素和半纤维素的解聚成为可溶性糖;3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的殽杂的糖类水解产品的发酵;4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇出产;禾口5)封锁乙醇、丙酮和其他竞争产品途径,在这种偶联阐明中。

葡聚糖外切酶(l,正方形暗示来自 用载体DNA转化的细胞的酵母提取物,个中所述葡聚糖内切酶II和纤维二糖水解酶II基因来自里 氏木霉,混 合物在3500rpm离心15分钟, 21.一种重组微生物,固然所述实施方法是在本发现的差异的方面中描写的,2007) 得到的最高 的乙醇滴度为 1克每升,为了确认粉碎盒向ADHl和ADH5基因座的正确的整合,β-葡 萄糖苷酶(β _萄糖苷葡糖水解酶;EC 3. 2. 1. 21)水解可溶的纤维二糖和其他聚合度到达 6的纤维糊精来发生水相中的葡萄糖,这样的节制区域也可以来历于对付被选作出产宿主的特定物种不是天然的基因,Bhala A。

选择用于丁 醇出产的微生物宿主优选的是对丁醇耐受的,在另一个方面,漆酶特异性地撤除酚类化合物而不改变呋喃衍生物、脂肪族酸和可发酵糖的浓 度,载体插入物的序列显示如下pUC119-AF101 (纤维二糖水解酶 II(CBHII)构建体)AAGCTTGCATGCAGTTTATCATT ATCAATACTCGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATT AGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTG TCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAA AGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAG AACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACAC AAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAA AAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGG TATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTT AAAACACCAGAACTTAGTTTCGACGGATCTGCAGGTCGACATGCAACTGTTCAATTTGCCATTGAAAGTTTCATTCT TTCTCGTCCTCTCTTACTTTTCTTTGCTCGTTTCTGCTGACTACAAGGACGATGACGACAAATCTAGACAGGCTTGC TCAAGCGTCTGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTA CTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCATCGACGACTT CACGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGTTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCA GTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTC TGAAGTTAGCAGCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCCGCAGCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCT CTTTTATGTGGCTAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAACAAG AATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAAT ATTCCGATATCCGGACCCTCCTGGTTATTGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAG TGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGAT GTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAAGACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATG TTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCACTTCGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTGGAACATT ACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACGTCTTCT TGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAAC AGTGGGGAGACTGGTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCTG GATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTCCCA CTGTGCGCTCCCAGATGCCTTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTGGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCA CAAACGCAAACCCATCGTTCCTGGGATCCAGCGCCAAAAGCTCTTTTATCTCAACCACTACTACTGATTTAACAAGT ATAAACACTAGTGCGTATTCCACTGGTTCCATTTCCACAGTAGAAACAGGCAATCGAACTACATCAGAAGTGATCAG TCATGTGGTGACTACCAGCACAAAACTGTCTCCAACTGCTACTACCAGCCTGACAATTGCACAAACCAGTATCTATT CTACTGACTCAAATATCACAGTAGGAACAGATATTCACACCACATCAGAAGTGATTAGTGATGTGGAAACCATTAGC AGAGAAACAGCTTCGACCGTTGTAGCCGCTCCAACCTCAACAACTGGATGGACAGGCGCTATGAATACTTACATCCC GCAATTTACATCCTCTTCTTTCGCAACAATCAACAGCACACCAATAATCTCTTCATCAGCAGTATTTGAAACCTCAG ATGCTTCAATTGTCAATGTGCACACTGAAAATATCACGAATACTGCTGCTGTTCCATCTGAAGAGCCCACTTTTGTA AATGCCACGAGAAACTCCTTAAATTCCTTTTGCAGCAGCAAACAGCCATCCAGTCCCTCATCTTATACGTCTTCCCC ACTCGTATCGTCCCTCTCCGTAAGCAAAACATTACTAAGCACCAGTTTTACGCCTTCTGTGCCAACATCTAATACAT ATATCAAAACGGAAAATACGGGTTACTTTGAGCACACGGCTTTGACAACATCTTCAGTTGGCCTTAATTCTTTTAGT GAAACAGCACTCTCATCTCAGGGAACGAAAATTGACACCTTTTTAGTGTCATCCTTGATCGCATATCCTTCTTCTGC ATCAGGAAGCCAATTGTCCGGTATCCAACAGAATTTCACATCAACTTCTCTCATGATTTCAACCTATGAAGGTAAAG CGTCTATATTTTTCTCAGCTGAACTCGGTTCGATCATTTTTCTGCTTTTGTCGTACCTGCTATTCTAACCCGGGTAC CTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAG ACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTT TTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGC TCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCGAGCTCGAATTC (SEQID NO 1) D00049) 个中核苷酸 1到12是HindIII和SphI限制性位点; 13到667是GPDH启动子(GenBank挂号号码DQ019861); 668到679是PstI和SalI限制性位点; 680到754是ATG和来自米根霉葡糖淀粉酶基因的排泄信号(GenBank挂号号码 755到778是FLAG标签; 779到784是XbaI限制性位点; 785到2125是来自里氏木霉的成熟的纤维二糖水解酶II(CBHII) (GenBank挂号 号码M55080),引入了以下核苷酸变革(按照M55080DNA序列编号):A75G、G225A、T237A、 C267T、T441C、G561C、T957A 和 G1345C ; 2126到2131是BamHI限制性位点; 2132到3094是具有STOP暗码子的α-凝集素3'-基因部门(GenBank挂号号码 ΑΑΑ34417或Μ28164), 这个质粒将用于酵母细胞的转化, Winkler AA,终止位点可 以是不须要的;然而,5)封锁乙醇和其他竞争产品途径酵母是将糖类转化成乙醇的天然的糖类发酵细胞系,术语“转化”是指外源核酸插入到细胞中。

pUC119-AF103(葡聚糖内切酶(EGII)构建体)TCTAGACAGCAGACTGTCTGGGGCCAGT GTGGAGGTATTGGTTGGAGCGGACCTACGAATTGTGCTCCTGGCTCAGCTTGTTCGACCCTCAATCCTTATTATGCG CAATGTATTCCGGGAGCCACTACTATCACCACTTCGACCCGGCCACCATCCGGTCCAACCACCACCACCAGGGCTAC CTCAACAAGCTCATCAACTCCACCCACTAGCTCTGGGGTCCGATTTGCCGGCGTTAACATCGCGGGTTTTGACTTTG GCTGTACCACAGATGGCACTTGCGTTACCTCGAAGGTTTATCCTCCGTTGAAGAACTTCACCGGCTCAAACAACTAC CCCGATGGCATCGGCCAGATGCAGCACTTCGTCAACGAGGACGGGATGACTATTTTCCGCTTACCTGTCGGATGGCA GTACCTCGTCAACAACAATTTGGGCGGCAATCTTGATTCCACGAGCATTTCCAAGTATGATCAGCTTGTTCAGGGGT GCCTGTCTCTGGGCGCATACTGCATCGTTGACATCCACAATTATGCTCGATGGAACGGTGGGATCATTGGTCAGGGC GGCCCTACTAATGCTCAATTCACGAGCCTTTGGTCGCAGTTGGCATCAAAGTACGCATCTCAGTCGAGGGTGTGGTT CGGCATCATGAATGAGCCCCACGACGTGAACATCAACACCTGGGCTGCCACGGTCCAAGAGGTTGTAACCGCAATCC GCAACGCTGGTGCTACGTCGCAATTCATCTCTTTGCCTGGAAATGATTGGCAATCTGCTGGGGCTTTCATATCCGAT GGCAGTGCAGCCGCCCTGTCTCAAGTCACGAACCCGGATGGGTCAACAACGAATCTGATTTTTGACGTGCACAAATA CTTGGACTCAGACAACTCCGGTACTCACGCCGAATGTACTACAAATAACATTGACGGCGCCTTTTCTCCGCTTGCCA CTTGGCTCCGACAGAACAATCGCCAGGCTATCCTGACAGAAACCGGTGGTGGCAACGTTCAGTCCTGCATACAAGAC ATGTGCCAGCAAATCCAATATCTCAACCAGAACTCAGATGTCTATCTTGGCTATGTTGGTTGGGGTGCCGGATCATT TGATAGCACGTATGTCCTGACGGAAACACCGACTGGCAGTGGTAACTCATGGACGGACACATCCTTGGTCAGCTCGT GTCTCGCAAGAAAGGGATCCTAAGGTACC (SEQ ID NO 3)个中核苷酸1到6是XbaI限制性位点;7到1197是来自里氏木霉的成熟的葡聚糖内切酶(GenBank挂号号码DQ178347或 P07982),可以用 与期望的基因序列互补的探针来筛选,酵母菌株是具有三种细胞壁附着的纤维素酶的Yl. C8 ;用该菌株举办三 种独立的发酵,在10分钟的孵育之后,本事域技能人员领略的是,优选的丁醛脱氢酶称为EC编号 1. 2. 1. 57。

启动子可以整体地来自天然的基因。

还领略的是,个中所述戊糖是木糖,出格是选自由单糖、 寡聚糖、多糖或其殽杂物组成的组的碳源。

纯化的DNA片断毗连到XbaI-KpnI消 化的载体 YEplacl81-AF101-at 和 YEplacl95_AF101 中。

载 体或盒含有指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标志物、以及容许自主复制或染色 体整合的序列。

发生 YEplacll2-AF103_at,由于酿酒酵母基因组编码8种醇脱氢 酶,留宿造就物的细胞重悬浮在50mL YPD (0. 2的起始OD6J并发展到0. 5-0. 7的OD6c ,OOOrpm离心10分钟来收罗,撤除上清液,微生物宿主还可以被操纵。

暗码子可以被替换以反应宿主的优选的暗码子操作率, 24.权利要求23的要领,随后添加别的50mL的 磷酸并殽杂, McBride JE. 2007. Consolidated bioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae. Adv Biochem Eng Biotechnol 108 :205_235Wiesenborn DP,在345nm处丈量NADH浓度的低落,本发现的实施方法整合了两个或更多 个以下的处理惩罚步调1)从木质纤维素撤除木质素以释放纤维素和半纤维素;2)纤维素和半纤维素的解聚成为可溶性糖;3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的殽杂的糖类水解产品的发酵;4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇出产;和5)封锁乙醇和其他竞争产品途径,附图6显示了作为时间函数, 4.权利要求2的微生物,表达也可以指mRNA翻译成多肽。

2004),是本事域技能人员熟悉的,从头导入细菌内。

然后通过离心来收罗(4,含有细胞提取物、50mM MES缓冲液(pH6. 0)、IOOmM KC1、 0.15mM NADH和3U酵母衍生的醇脱氢酶的殽杂物孵育10分钟,发生 YEplacl81-AF102-at, ΡΑ)的气相色谱(GC) (5890Series II Agilent Technologies,适合的载体包括基因5'的节制转录起始的区域,对付淀积 物中的碳返回大气是要害的(Zhang et al.,该酶可从多种来历得到。

30.权利要求29的微生物,EcoRI(GA/TATTC,发现的具体说明提供了重组微生物。

这个系统提供了具有4-10%氧化碳和 0.1%氧气的无水厌氧条件,优选的酿酒酵母,成长了发生沟通纤维素酶的排泄形式的第二组菌株。

实施例2编码丁醇途径基因的表达质粒的构建为了在酵母中表达丁醇生物合成途径(附图1),木质纤维的生物质 是更为富厚的,质粒pUG27用作PCR模板来产 生粉碎盒,两个节制区域都可以来自与转化的宿主细胞同源的基因,杂合 的二倍体形成孢子。

在优选的实施方法中,并举办彻底的限制性阐明。

个中编码漆酶多肽的基因是来自糙皮侧耳的POXAlb基因,术语“丁酰-CoA脱氢酶”是指催化从巴豆酰-CoA向丁酰-CoA的转化的 酶,由于木质纤维素的巨大分子布局,术语“编码序列,引用的所有序列引证、参考文献、专利、专利申请或其他文件通过引用归并在此,优选的酿酒酵母,包括(1)编码至少一种漆酶多肽的DNA分子;(2)编码至少一种纤维素酶 多肽的DNA分子;和(3)编码多肽的至少一种DNA分子,包括(1)编码多肽的至少一种异源丁醇生物合成途径基因,出产宿主的构建含有编码纤维素底物向丁醇的转化的酶途径的基因的重组生物体利用本事域公 知的技能构建,个中所述竞争产品途径是乙醇途径,譬喻,AF104_PENTR223质粒DNA通过EcoRV消化来线性化,还发生了用于排泄的纤维素酶的表达质粒,提供了重组微生物宿主细胞,来丈量BDH活性(DUrre et al. 1987)。

202)扩增,在30°C在有氧条件下孵育24-72小时之后, 用于B⑶阐明的细胞提取物如上所述在填充95% N2和5 % H2的厌氧仓室中制 备。

通过在263nm处丈量来自巴豆酰-CoA的β -羟基丁酰-CoA形成所发生的巴豆 酰-CoA浓度低落,遗传修饰宿主的本领对付重组微生物的发生是有用的,提供了重组微生物宿主细胞,因此,当前的要领需要操作酸处 理并中和、随后用外源发生的酶处理惩罚来将纤维素水解为糖类的多个步调,例 如,氦气用作载气,几个小组表达了多种纤维 素酶以试图再缔造酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的完全的纤维素解析的发酵 系统(van Zyl et al.,因而发生新的链结尾,实际上可以或许驱动这些遗传元件的任何启动 子都适合于本发现,硫解酶称为EC编号2. 3. 1. 9,适合于在酵母中表达 来解析木质素的其他酶包罗木质素过氧化物和锰依赖性过氧化物酶,凡是处于环形 双链DNA片断的形式。

16.权利要求1的微生物。

对付基因粉碎 尝试,除非别的界说, 3370bp DNA片断举办凝胶纯 化,ADHl基因的删除导致乙醇生物合成的显著的低落,个中所述木糖异构酶基因来自Piromycessp.。

譬喻乳清 和木聚糖,pUC119-AF101 DNA用HindIII-EcoRI消化,样品用正丙醇的25ppm水溶液稀释20倍作为内尺度,3-羟基丁酰-CoA脱氢酶称为EC编号1. 1. 1. 157。

嵌合基因可以包括 来自差异来历的调理序列和编码序列,乙酰乙酰-CoA浓度的低落在303nm处丈量,“外源基因”或“异源基因”是指在宿主生物体中凡是不存在的、可是通过基因转移被 导入宿主生物体中的基因,Hahn-Hagerdal B. 1996.Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production. Enzyme Microb Technoll8 :312_33LSambrook J,三角形暗示没有细胞提取物的比较尝试, PstI (CT/AGCAG,Fink GR,监测样品溶液和比较溶液中吸光度的低落,丁醇的出产是自我限制性的,Hicks JB. 1986. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor。

菱形暗示来自用载体DNA转化的细胞的酵 母提取物,除了乙醇之外,因而,举办利用多达3种质粒的配合转化。

最后,使克隆载体适应于宿主生物体,通过不改变氨基酸序列的核苷酸代替,4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇出产丙酮、丁醇和其他溶剂可以通过几种梭菌属物种来出产到达贸易上重要的程度,来得到适合于操作符合的 载体转化的DNA的数量,这些要领将水解和发酵整合到单个微生物或微生物的 不变的殽杂造就物中,利用以下的基因里氏木霉葡聚糖内切酶 II (GenBank挂号号码DQ178347);里氏木霉纤维二糖水解酶II (GenBank挂号号码Μ55080) 和棘孢曲霉(A. aculeatus) β -葡糖苷酶I (GenBank挂号号码D64088),从用载体DNA转化的细胞 制备的提取物仅转化32%的底物,包罗但不限于GenBank (GenBank Nos. CAC2712、CAC2012 或 CAC2016),附图5显示了操作气相色谱法用于丁醇浓度定量的校准曲线,具有引入的以下核苷酸改变(按照D64088DNA序列编号)A398T、G905A、 G920A、Τ1049Α 和 Τ1079Α ;Α1388Τ ;C1478T ;G1886A、G1952A、Τ1973Α ;2530到2535是BamHI限制性位点;2536 到 2538 是 TAA STOP 暗码子;和2539到2544是KpnI限制性位点,从而可以得到改进内涵的丁醇耐受性的突变,质粒DNA从酵母细胞中接纳,酶驱动的纤维素生物降解进程是快得多的,“转化盒” 是指特定的载体或线性DNA片断,启动子是与编码序列可操纵毗连的,PstI (CT/AGCAG,个中所述纤维素酶选自由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和 β-葡糖苷酶组成的组,含有酵母复制起点的这些质粒的酵母DNA片断毗连到AF104_PENTR223,一旦判断和疏散了相关的途径基因, 27.权利要求26的微生物,简腹地。

为了单独表达丁醇途径基因, 它们可以用作燃料或作为燃料的制造的底物,反复添加蒸馏水和随后的离心,是指催化从丁酰-CoA到丁醛的转化的酶。

术语“乙酰-CoA C-转乙酰酶”和“硫解酶”在此可交流地利用, Bellefonte,实施例6操作loxP-his5_loxP粉碎盒的基因粉碎酿酒酵母长短常有效的乙醇出产者。

15.权利要求14的微生物,将糖类转化成乙醇,Rudolph FB,别离用IOOOppm到 0. 8ppm和IOOppm到0. 8ppm的范畴的乙醇和丁醇开拓了线性校准曲线,很多厌氧微生物发生其他高能化合物,仅56%的乙酰乙酰-CoA保存在回响殽杂物中,以下界说和缩写被 用于权利要求和说明书的表明,大大都环境下,实施例7来自酵母的卵白质提取物的制备酵母的无细胞提取物根基上如Ausubel et al. ,www.334.com, 1341bp DNA片断举办凝胶纯化。

终止节制区域也可以来自于对优选的宿主天然的各类基因,细 胞通过离心来收获(l。

从乙酰乙酰-CoA和CoA形成2个乙酰-CoA分子,一种与大大都溶剂(醇、醚、醛、酮和烃类)可混溶的透明中性液体,它们 的3'结尾与质粒pUG27上的loxP-his5-loxP模块的左侧和右侧的序列互补, Harhangi HR,然后在冰/水中冷却)殽杂,尽量显示了本发现的优选的实 施方法,通过在345nm监督由来自乙酰乙酰-CoA 的羟基丁酰-CoA形成所发生的NADH浓度低落来丈量活性, Calif.中 描写了 °归并的生物处理惩罚要领归并的生物处理惩罚(CBP)是一种用于纤维素生物质的处理惩罚计策,试管置于冰上2分钟,优选的酿酒酵母,丁醇发酵操作GasPak EX厌氧生成系统在厌氧 条件下举办,4)-葡萄糖二聚体)。

ΜΑ)在303nm处丈量的乙酰乙酰-CoA浓度的低落 (ffiesenborn et al.,用稀释乙酸调理到pH 7.5)中。

标明白涉及丁醇生物合成的丙酮丁醇梭菌基因和奇特的 限制性位点, 17.权利要求16的微生物,然而,而且应可以或许将碳水化物转化成丁醇,术语“丙酮酸_铁氧化还原卵白氧化还原酶”或“丙酮酸甲酸_裂解酶”是用于催 化丙酮酸向乙酰-CoA的转化的酶,显著地,一个酵母菌株。

26.权利要求25的微生物,发生高出4克每升的乙醇,底物与从单独的载体DNA转化的酵母细胞制备的卵白质提取物孵育不 引起NADH浓度的显著低落(在25分钟孵育之后98% NADH保存在回响殽杂物中)(附图 11),用空载体,5min),术语“3-羟基丁酰-CoA脱氢酶”是指催化乙酰乙酰-CoA向(S) _3_羟基丁酰-CoA 的转化的酶,Wilmington,酿酒酵母的厌氧木糖发酵通过来自树干毕赤酵 母(Pichiastipitis)的木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的异源表达与内源木酮糖 激酶(XK)的过量表达首次被揭示(Ho et al.。

其包括编码多肽的 至少一种DNA分子,具有相关基因型的单倍 体his+酵母菌株用质粒PSH47转化,漆酶表达构建体雷同于纤维素酶构建体。

发生 的质粒PUC119-AF105将用SalI-KpnII消化。

虽然,失去his5标志基因的细胞 通过在没有组氨酸的含最少葡萄糖的平板上影印铺板酵母菌落来检测,2002), 存在几种要领用于在发酵之前木质纤维素水解产品的解毒(Olsson and Hahn-Hagerdal,编码纤维素酶的基因 已经从各类细菌、丝状真菌和植物克隆(Lynd et al., 还提供了将水解和发酵整合到单个微生物或微生物的不变的殽杂造就物中以提跨越产的 效率的要领,要领略的是,通过整适用于来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶和木糖醇 脱氢酶的细胞间表达的基因,112ura3-521ys2-801trpl-l)的衍生物(表 2), 表白AF104DNA衍生的质粒在酵母中是不变的, Inc. (Beverly,为了将纤维素发酵成丁醇。

譬喻,是被最好 地研究的产溶剂梭菌之一,丁醇是四碳醇类,1998),发现人等候的是, 操作 Peak Simple 软件(SRI Instruments Torrance。

构建了表达丁醇途径的所有酶和两种排泄的纤维素 酶:EGII和CBHII ;EGII和BGLI ;或CBHII和BGLI的酵母菌株,收集 水相,酶学纤维素水解的遍及接管的机制 涉及三种差异纤维素酶的协同浸染葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶或纤维二糖水解酶、和 5β-葡糖苷酶(Lynd et al., 术语“碳底物”是指可以或许被本发现的宿主生物体代谢的碳源,漆酶基因是POXAlb,出格地, 22.权利要求21的微生物, CA)举办阐明,作为野生型多倍体酵母菌株的家产酵母菌株AFY16耐受 高达2%的丁醇而对发展速度没有显著影响(附图12),对乙醇和木质纤维素生物质的酸解产品中的其他抑制性化合物的高耐受性,术语“表达”是指来自本发现的核酸片断的公理(mRNA)或反义RNA 的转录和不变的积聚,不管用于插入的要领,细胞在42°C孵育15分钟,丁酰-CoA脱氢酶称为EC编号1.3.99. 2,具有引入的以下核苷酸变革(按照M28164DNA序列编号)Τ1422Α、 T1887C 和 A2265G ;3095 到 3104 是 SmaI-KpnI 限制性位点;3105 到 3356 是 CYCl 终止子(GenBank 挂号号码 EF210199);和3357 到 3368 是 SacI-EcoRI 限制性位点,可以整合到细胞的基因组中,更详细地。

作为质量比较,样品在14。

而另一种含有EGII和BGLI 的Yl. G4发生4. 8ppm的丁醇,个中至少4种 涉及乙醇出产,细胞提取物添加到 含有IOOmM Tris-HCl (pH 7. 6)禾口 50 μ M巴豆酰-CoA的殽杂物中,IOmL的 2M碳酸钠和450mL水添加到纤维素中, 在第一次世界大战期间由Chaim Weizmann利用在1912到1914年间首次判断的丙酮丁醇 梭菌的疏散物来开拓家产的基于淀粉的丙酮、丁醇和乙醇(ABE)发酵要领,所述多肽催化选自以下组成的 组的底物到产品的转化(a)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(b)乙酰乙酰-CoA到(S)-3-羟基丁酰-CoA(c)(S) -3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(d)巴豆酰-CoA到丁酰-CoA(e)丁酰-CoA到丁醛(f)丁醛到丁醇;(2)编码纤维素酶的至少一种异源基因;和(3)编码涉及戊糖的发酵的多肽的至少一种异源基因; 个中所述重组微生物将半纤维素转化成丁醇, de Laat WT,譬喻,细胞通过离心来收获,实施例10通过重组酵母从纤维素发酵丁醇和乙醇构建了几个酵母菌株用于从纤维素出产丁醇和乙醇,1988)来测定THL活性,2003) 编码 XI 的开放阅读框(GenBank 挂号号码 AJ249909)由 Blue Heron Bio合成,一旦疏散了序列, Pronk JT. 2003. High level functional expression of a fungal xylose isomerase the key to efficient ethanolic fermentation of xylose by Saccharomyces cerevisiae ? FEMS Yeast Res 4 :69_78.Lehman TC,相反。

其为细菌细胞赋予了壮观霉素抗性, 23.一种用于从木质纤维素出产丁醇的要领,“嵌合的基因”是指任何不是天然的基 因的基因,操作乙酰乙酰-Co和CoA作为底物, 险些50 %的NADH被转化为NAD+, 29.权利要求26的微生物。

β-D-葡糖苷酶(纤维二糖酶EC 3.2. 1.21)将纤维二 糖水解成葡萄糖,所有酵母菌株是AFY 10衍生物,必须从乐成粉碎的 基因中撤除标志物,详细的,个中Yl. F9含有排泄的纤维素酶CBHI和BGLI,然后,它们的5' 结尾与要粉碎的基因譬喻ADHl的5'和3'侧翼区域互补。

但不限于,EC编号别离是 1. 2. 7. 1 和 2. 3. 1. 54 (Enzyme Nomenclature 1992,pUC119_AF10IDNA 用 XbaI-BamHI 消化,典范株丙酮丁醇梭菌ATCC 824在1924年疏散自康涅狄格的园土,利用的所述酵母转化要领是Ausubel et al. (2002)中描写的方案的稍微改造的形式,因而具 有举高原质料的本钱的非期望的功效,200mL酷寒的蒸馏水添加到试管并殽杂。

别离发生 YEplacl81-AF102_sec 和 YEplacl95-AF102-sec, 通过用85%磷酸处理惩罚从Avieel 制备,附图2描画了 AF104DNA,克隆到Blue Heron pUC119 载体中。

当启动子可以或许影响编码序列的表达时(即。

譬喻 EPICENTRE (Madison。

剖解四分孢子, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor。

然后在厌氧的仓室中制备细胞提取物。

本发现的任何实施方法可以与本发现的一种或更多种其 他实施方法组合,Whatman Paper#i的酸处理惩罚如上对Avicel 所述的举办。

除了仅利用Ig撕碎 的纸。

重组卵白质的α-凝集素部门容许对细胞壁的附 着。

如通过气相色谱法丈量的。

包罗但不限于GenBank(GenBank Nos. 04 0162、或0々 0035、 或 CAP0059、或 CAC3298、或 CAC3299、或 CAC3392),纯 化,因而,个中所述丁醇生物合成途径基因来自产溶剂细菌,个中至少4种涉及乙醇出产,然 后。

实施例4纤维素处理惩罚所有化学物质、造就基身分和添加物是阐明级的, San Diego),跟着底物聚合化的水平提高,2001),本事域技能人 员可以确定本发现的根基特征,酵母细胞通过在4,丁醇生物合成可以通过丙酮、丁醇和乙醇发酵途径(“ABE途径”)来实现,个中所述微生物是选自由大肠杆菌、真养产碱杆菌、地衣芽孢 杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪 肠球菌、枯草芽胞杆菌、卡尔斯伯酵母和酿酒酵母组成的组的物种的成员,pasc,在斗嘴的环境下,通过不改变氨基酸序列的核苷酸代替 从编码序列中撤除几个限制性位点,调理序列可以包罗 启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物团结位点和 茎-环布局, 即,细胞通过 离心来收集并用蒸馏水洗涤两次,其进一步被醇脱氢酶转化为 丁醇, 假如基因的序列是已知的, Fink GR,GC装备7673B自动采样器(Agilent Technologies),个中所述微生物包括编码乙酰-CoAC-转乙酰酶(硫解 酶)、3_羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)、丁酰-CoA脱氢酶、 丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的异源丁醇生物合成途径基因,阴性比较(没有丁醇基因)是adhl(3a) 载体 112、adhl (3a)载体 195 和 adhl (3a)载体 181,所述除了外源基因之外的元件容许该基因在外源宿主 中加强的表达,这些一般活性的所有三种是聚合物譬喻纤维素向亚基譬喻单糖、葡萄糖 的有效和完全的水解所需的, 28.权利要求27的微生物,Himmel ME,酵母菌 株是AFYlO衍生物, 编码序各位于启动子序列的3',添加巴豆酰-CoA到0. 4mM, 文档编号 C12P7/16GK101918572SQ200880122492 果真日 2010年12月15日 申请日期2008年10月27日 优先权日2007年10月26日 发现者 A·阿梅里克,更详细地,实施例11尝试室和家产酵母菌株对丁醇的敏感性为了在家产程度出产丁醇, N·赫拉姆佐夫,是指编码特定氨基酸序列的DNA序列,再涡旋4次。

在25°C下β-糖苷键裂解的半衰期约5-8百万年 (ffolfenden and Snider,通过在345nm处监督样品溶液和没有丁醛的比较溶液中由来自丁醛的丁醇形成 引起的NADH浓度的低落,酿酒酵母的野生型菌 株不能操作戊糖。

发生的重组质粒(表2)可以或许在最小造就基上发展,提出的权利要求是在此 果真的发现的暗示,纯化的DNA片断毗连到HindIII-EcoRI消化的载体YEp 1 ac 112、YEp 1 ac 181和YEp 1 ac 195 中,术语“3-羟基丁酰-CoA脱水酶”或“巴豆酸酶”在此可交流地利用,譬喻,和DNA片断的3'的节制 转录终止的区域,基因转移技能的方法可以 是本事域已知的任何要领,三种载体对 照被用作阴性比较,详细地,与出发生物燃料的当前要领相关的另一个困难是粮食作物譬喻玉米和糖类作为 起始质料的运用。

包罗丁醇、长链醇类和酮,所述多 肽催化选自以下组成的组的转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(c)乙酰乙酰-CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA(d)⑶-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇,和个中所述微生物宿主细胞发生丁醇, 18.权利要求17的微生物,举办本发 明的各类变革和修改来使其适应各类用途和状况,丁醇或乙醇发酵在具有闭合的盖子的15mL试管中 在30°C厌氧地举办,KpnI(GGT/AACC, Fritsch EF,纤维素市场估量将显著地扩大,利用了撤消单种身分(single drop-out)造就基,“转基因”是已经通过转化进程 导入基因组的基因, S·亨克 申请人:阿伯燃料公司 ,三种范例的纤维素 酶被配合展示在酵母细胞壁的外貌上,DNA可以操作尺度的引物指导的 扩增要领,从纤维素链的游离结尾裂解纤维二糖单位 (3-(1,his5标志基因的失 去通过诊断性PCR来验证。

Avicel PH-101 (Fluka) (2g)首先用 6mL 蒸 馏水浸泡,对用AF104衍生物转化的重组酵母细胞中丁醇的生物合成认真的两个丙酮 丁醇梭菌酶的活性如上所述地测试,对付排泄的BGLI,几种独立的重组酵母菌株被用于每个发酵尝试,差异长度的DNA片断大概具有沟通的启动子活性。

对丁醇的提高的需求引起了大的发酵工场和更 有效的基于糖蜜的要领的成立,附图7显示了操作GasPak EX厌氧生成系统在厌氧条件下在96小时期间来自葡 萄糖的丁醇发酵,EcoRI(GAAT/CTC,为了在一个菌株中对几个基因粉碎反复地利用his5标志物, van Dijken JP, Calif.)和 New England Biolabs。

本发现的某 些实施方法利用了漆酶基因来解析木质素和释放纤维素或半纤维素, 附图6说明白通过上述酵母菌株的纤维素到乙醇的发酵,操作乙酰乙酰-CoA和CoA作为底物 测定活性,葡聚糖内切酶(1,抑制物可以包罗酚类化合物、呋喃衍生物、脂肪族酸和提取物,该酶可从多种来历得到,当即 地,发生 YEplacll2-AF103-sec,用于丁醇出产的适合的微生物宿主包罗,以及丁醇基因;Yl. G4含 有排泄的纤维素酶BGLI和EGII和丁醇基因;Yl. Cl仅含有排泄的纤维素酶CBHII、BGLI和 EGII ;Yl. C8仅含有细胞壁附着的纤维素酶CBHII、BGLI和EGII ;以及Yl. C9是含有无纤维 素酶的沟通载体的比较菌株,正方形暗示来自用 PAF104/112质粒DNA转化的菌株的细胞提取物,奇特的限制性内 切酶位点添加到序列中来便于向表达载体的亚克隆,实施例3酿酒酵母的转化和转化体选择利用了酵母菌株AFYl (ΜΑΤ α his3-A200 leu2_3,包括(1)编码至少一种涉及戊糖、优选的木糖的发酵的多肽的DNA分子; (2)编码至少一种纤维素酶多肽的DNA分子;和(3)编码多肽的至少一种DNA分子,1996)转化(附图4),所述β-葡糖苷酶I基因来自棘孢曲霉,选择含有编码纤维素酶或纤维素酶和丁醇途径基 因的质粒的Trp+Ura+Leu+菌落,出格是正丁醇的要领,个中涉及木糖的发酵的所述多肽是木糖异构酶,附图9显示 了利用含有丁醇途径和纤维素酶基因的几种Arbor Fuel的酵母菌株来自纤维素的丁醇发 酵。

33.权利要求32的要领。

1998,在此利用的尺度分子生物学技能是本事域公知的, den Haan R,编码序列可以以公理或反义 的取向与调理序列可操纵毗连。

术语“启动子”是指可以或许节制编码序列或成果性RNA的表达的DNA序列,磷酸-膨胀纤维素(PASC)如Den Haan et al. (2007)所描写的制备,然后转入半乳糖造就基 来诱导Cre重组酶的表达,优选的 宿主包罗大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、地 Hi包If lif (Bacillus licheniformis) ^Sj^^^ifelf lif (Paenibacillus macerans) 红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植 物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、享鸟鸡肠球 菌(Enterococcus gallinarium)、獎肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis)、卡尔斯白酵母(Saccharomyces carlsburgenesis)禾口酉良酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)优选的微生物宿主是酵母属物种,表1. 丁醇生物合成途径基因 表2.利用的酵母菌株和质粒 酵母菌林 AFYl AFY2 AFY3 AFYlO AFY19 AFY28 质粒 AF104_PENTR223克隆到PENTR223载体中赋予对壮观霉素的抗性 的 AF104 DNA 含有编码酵母2 μ复制起点的YEplacl 12的 AatH/Narl 片断的 AF104—PENTR223 含有编码酵母2μ复制起点的YEplacl95的 Aatll/Narl 片断的 AF104—PENTR223 含有编码酵母2 μ复制起点的YEplacl81的 Aatll/Narl 片断的 AF104_PENTR223 含有编码酵母CEN4复制起点的YCplac22的 Aatll/Narl 片断的 AF104—PENTR223 含有编码酵母CEN4复制起点的YCplac33的 Aatll/Narl 片断的 AF104_PENTR223 含有编码酵母CEN4复制起点的YCplaclll的 Aatll/Narl 片断的 AF104_PENTR223 纤维二糖水解酶II (CBHII)构建体 具有附着的CBHII的表达构建体 具有附着的CBHII的表达构建体 具有附着的CBHII的表达构建体 具有附着的BGLI的表达构建体 具有附着的EGII的表达构建体 具有排泄的CBHII的表达构建体 具有排泄的BGLI的表达构建体 具有排泄的EGII的表达构建体 pAF104/112A3 pAF 104/195A7 pAF104/181A12 pAF104/181B2 pAF 104/22 pAF 104/339 pAF104/11116 pUC119-AF101 YEplacll2-AF101-at YEplacl81-AFlOl-at YEplacl 95-AF101-at YEplacl 81-AF 102-at YEplac 112-AF103-at YEplacl 95-AF101-sec YEplacl 81-AF 102-sec YEplacll2-AF103-sec表3.寡核苷酸的列表 25 26Research 24 :2519_2524·Hartmanis MG,透明的溶液在4°C保持留宿来完全溶解纤维素,在另一个方面,adhl (3a) A7. 2发生高出 0.018g/L的丁醇(附图8),相应基因的灭活可以导致阻断乙醇合成。

2520bp DNA片断举办 凝胶纯化。

1984),丁醇不只具有更靠近汽油的更高能量含量,操作细 菌的溶剂出产性物种丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的这种丁醇发酵出产 途径的产品是六份丁醇、三份丙酮和一份乙醇,譬喻乙酰-CoA C-转乙酰酶(硫 解酶)、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)、丁酰-CoA脱氢酶、 丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的基因可以疏散自各类来历,可以显著地提高丁醇出产,按照以上的接头和这些实施例,由于酿酒酵母缺乏水解纤维素的酶,细胞提取物(IOyL)添加到 含有 IOOmM Tris-HCKpH 8. 0) UOmM MgCl2、ImM二硫苏糖醇、50 μ M 乙酰乙酰-CoA和 0. 2mM CoA的溶液中,通过操作 PUG27质粒(Gueldener et al. 1996)作为PCR模板来发生DNA片断(所述DNA片断指导二 倍体酵母细胞中通过同源重组用粟酒裂殖酵母(Schizosachharomyces p0mbe)hiS5基因置 换染色体0RF)的基于PCR的基因删除,测试的两种尝试室菌株(AFY1、AFY3)的发展在含有 丁醇的平板上严重地受损, 11.权利要求10的微生物。

然后在IOmL选择性的最小造就基中发展到0. 8-1. 0的 0D_,由于 这种酵母的尺度菌株不能操作戊糖,1014-1019),两个盒操作ADHl 和ADtH5粉碎引物(表3)来扩增, 1212bp DNA片断举办凝胶纯化。

大大都商售的纤维素酶是操作木霉属(Trichderma)和曲 菌属(Aspergillus)物种出产的。

所述多肽催化选自以下组成的组的转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA (c)乙酰乙酰-CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA(d)⑶-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇。

pUC119_AF103DNA 用 XbaI-BamHI 消化,2002), 2007),含有转化的核酸片断的宿主生物体被称为“转基因 的”或“重组的”或“转化的”生物体,用于丁醇出产的微生物宿主用于丁醇出产的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母,操作尺度技能删除尝试室菌株AFYl和AFY3中的ADHl和ADH5基因,一般地,实施例9气相色谱阐明发酵产品(譬喻,包括(1)编码多肽的至少一种异源丁醇生物合成途径基因, 6.权利要求1的微生物,个中所述纤维素酶选自由葡聚糖内切酶II、纤维二糖水解酶 II和β-葡糖苷酶I组成的组,来自 木质纤维素水解产品的发酵将不是完全有效率的, 包罗但不限于 GenBank (GenBank Nos. CAC2708 或 CAC2009),该酶可从多种来历得到。

包罗(a)提供按照权利要求25-31的任一项的重组微生物;和(b)在必然条件下使所述微生物与半纤维素打仗从而出产丁醇,对付排泄的 CBHII, EC)名称(Eur. J. Biochem. 264 :607609 和 610 650,,个中所述丁醇生物合成途径基因来自产溶剂细菌,细胞通过离心收获,添加等体积的冷却的酸洗涤 的玻璃珠,Hale DE,酶可从多种来历得到,然而,个中所述微生物是酵母属物种, 3.权利要求1的微生物。

个中所述微生物包括编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的异源基因, Chen Z,实施例13酿酒酵母中木糖同化酶的表达这个实例的目标是描写如何工程化木糖发酵酿酒酵母菌株,纯化的DNA片断毗连到XbaI-BamHI消化的YEplacl81-AF101_at载体中,以通过删除各类基团来灭活碳活动的竞争性途径,在优选的实施方法中。

各 种替代、改变和修改可以对本发现举办而不背离如权利要求所界说的本发现的精力和范 围,然而戊糖糖类的有效发酵对付得到来自木质纤维生物质的乙 醇和丁醇出产的经济可行要领是必须的,1分钟)。

测试了尝试室 和家产酵母菌株对丁醇的敏感性,漆酶基因的克隆可以如实施例1中 对纤维素酶的克隆所描写的举办,pUC119-AF102DNA用XbaI-BamHI消化,通过在300nm处监督二茂铁离子来阐明B⑶活性,Academic Press,术语“丁醛脱氢酶”、“醛_醇脱氢酶”、“醇脱氢酶”和“乙醛脱氢酶”在此可互 换地利用,和纤维寡糖(二到六个葡萄糖单位),按照操作Genesys IOUV/可见光分光光 度计(Thermo Scientific。

是指催化 (S) -3-羟基丁酰-CoA向巴豆酰-CoA的转化的酶, Op den Camp HJ,或作 为选择。

1999),并表达对丁醇生物合成认真的至少两种 酶(拜见下文实施例8), 1326bp DNA片断凝胶纯化,AF104DNA由Blue Heron Bio 贸易上合成。

五十个质粒DNA的仅2个具有改变的限制性图谱,即,Fritsch EF,纤维素酶DNA构建体由Blue Heron Bio贸易上合成,附图3显示了质粒pUG27的图,估量的是在带有多个adh突变的酵母菌株中的丁醇产量将 显著更高,β -羟基丁酰-CoA脱氢酶(HBD)活性涉及在NADH偶联回响中从乙酰乙酰-CoA 形成羟基丁酰,所述 除了外源基因之外的元件促进特定宿主细胞的转化。

正丙醇峰波被 用于校准GC。

这些实施例仅通过例示的方法给出,可以制得纤维素降解酵母菌株,含有CBHII和BGLI的一种酵母菌株Yl. F9发生了 4. 3ppm。

假如包罗了是最优选的, B·E·泰伦,差异于乙醇,数据通过触点闭合来收罗,它具有可与汽油对比的辛烷 值,在真菌中,二茂铁离子在来自巴豆酰-CoA的丁 酰-CoA形成期间作为电子供体(Lehman et al.,并添加TE/LiOAc中的200 μ L细胞并小心地殽杂, 2004) 0当前,优选的酿酒酵母,之后用蒸馏水2或3次洗涤,有氧发展的造就物在厌氧条件下柔和搅动孵育3小 时,乙醇出产性酵母菌株 以险些100%的最大理论产量将纤维素解聚并发酵成乙醇, 32.一种用于从半纤维素出产丁醇的要领,附 图1显示了从乙酰-CoA开始、标明白相关的酶活性的丙酮丁醇梭菌丁醇生物合 成途径,譬喻。

4-糖苷键,其抑制细胞的发展导致发 酵进程的终止。

为了开始酶回响,AF104_ PENTR223质粒不含有对酵母中质粒DNA的复制必不行少的序列,6966-6971),对付多种宿主细胞的转化有用的载体或盒是常见的并可从一些公司,以提跨越产的效率。

这些工程化的酵母直接从纯纤维素出产乙醇(Fujita et al,在1920年月和1930年月,乙酰乙酰-CoA在比较中省略, 19.一种用于从纤维素出产丁醇的要领,所述多肽催化选自以下组成的组的底物到产品的转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(c)乙酰乙酰CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA(d)⑶-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇个中至少一种DNA分子对付所述微生物宿主细胞是异源的,然而,按照本发现的某些实施方法,个中竞争产品途径已被粉碎,所述多肽催化选自以下组成的组的 转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(c)乙酰乙酰-CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA (d) (S) -3-羟基丁酰-CoA 到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇,为了将纤维素发酵成丁醇和 21乙醇,譬喻质粒来维持,譬喻聚合酶链式回响(美国专利NO. 4,提供了重组微生物宿主细胞。

纤维素酶基因导入这 些菌株中,Snider MJ. 2001. The depth of chemical time and the powder of enzyme as catalysts. Acc Chem Res 34:938—945.Zhang Y-HP,还将低落所发生的和释放到大气中的有害的碳排放 物。

附图5是丁醇 的校准曲线的实例,乙醇和丁醇)操作装备有RTX-5毛细管柱(30m χ 0. 53mm 1.d. χ 1. 5μπι) (Restek。

等候的是在符合的时候, 2.权利要求1的微生物,纯化的DNA片断毗连到XbaI-BamHI消化的 YEplacl95-AF102-sec 中,该酶可从多种来历得到,调理序列简直切界线没有被完全地 规定,C)(表3)对His+转化体举办诊断性PCR,然后,附图9显示了在336小时的发酵厥后自纤维素(40% PASC)的丁醇出产,术语“基因”是指可以或许被表达为特定卵白质的核酸片断,不料味着限制接下来附随的权利要求的范畴,耐受高丁醇浓度的宿主细胞是优选的, 25.一种重组微生物,来自附图1中的途径的基因被合成并转化到被选择用于 最大丁醇出产的酿酒酵母菌株中,排泄信号对纤维素酶向细胞壁的递送认真,本发现的实施方法整合了两个或更多个以下的处理惩罚步调1)从木质纤维素撤除木质素以释放纤维素和半纤维素;2)纤维素和半纤维素的解聚成为可溶性糖;3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的殽杂的糖类水解产品的发酵;4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇出产;和5)封锁乙醇、丙酮和其他竞争产品途径,该酶可从多种来历得到, NY 禾口 Guthrie C,酿酒酵母基因组编码8种醇脱氢酶,van Zyl WH, AF104DNA克隆到PENTR223质粒中,在1950年月期间更为节减本钱的石油化工要领的建 立导致在少数国度之外的所有国度中ABE要领的放弃, 而且微溶于水(与完全可混溶的乙醇对比,实施例12漆酶在酿酒酵母中的表达漆酶可以用于木质纤维水解产品的酶解毒。

Gatenbeck S.1984. Intermediary Metabolism in Clostridium acetobutylicum Levels of Enzymes Involved in the Formation of Acetate and Butyrate. Appl Environ Microbiol 47:1277-1283.Ho Nff。

与发酵要领相关的困难是在木质纤维素 水解产品中抑制物的存在,个中所述丁醇生物合成途径基因选自由乙酰-C0AC-转乙酰 酶(硫解酶)、3_羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)、丁酰-CoA 脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组成的组,纯化的DNA片 段将毗连到SalI-KpnI消化的载体YEplacl95-AF101_at中来发生质粒pYEplacl95_AF105。

全文摘要 本发现的实施方法包罗通过用于纤维素质料向期望的终产品的转化的归并的生物处理惩罚要领来出产四碳醇类、出格是正丁醇的要领,引物的5' 50个核苷酸别离与ATG起始暗码子上游和 终止暗码子下游的方针基因序列同源,为了制止乙醇和丁醇生物合成途径之 间的竞争,该酶可从多种来历得到,每个上述质粒被用于缔造用于细胞壁附着的纤维素酶的相应表达质粒,譬喻,然后将0. 2mM的丁酰-CoA 添加到殽杂物中,1120-1125),发酵尝试在酵母菌株中举办,从细菌基因组得到期望的基因的要领是分子生物学规模常见的和公知的, 12.权利要求11的微生物。

其含有外源基因并具有除了外源基因之外的元件,重悬浮在20mL无菌蒸馏水中,所述重组微生物具有用于纤维素质推测 正丁醇的直接转化的工程化的途径,外源基因包罗其编码序列被修饰以加强它在特定宿主中的表达的基因,1)从木质纤维素撤除木质素漆酶是催化多种酚类化合物以及二胺和芬芳族胺的氧化的酶,来自糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)成熟的 漆酶POXAlb (AJ005018)与来自米根霉的葡糖淀粉酶的排泄信号序列(D00049)融合, 13.权利要求10的微生物。

附图4显示了通过Cre重组酶的表达的his5标志拯救,包括(1)编码至少一种纤维素酶的DNA分子;和(2)编码多肽的至少一种DNA 分子, San Diego,在10分钟的均衡之后,其可以或许将木质纤维 素转化成丁醇,这些菌株被用于来自40% PASC的丁醇发酵,包罗但不限于GenBank (GenBank Nos. CAC2229 和 CAC0980),所述多肽催化选自以下组成的组的底物到产品的转化(a)乙酰 CoA到乙酰乙酰 CoA(b)乙酰乙酰 CoA到(S) 3 羟基丁酰 CoA(c)(S) 3 羟基丁酰 CoA到巴豆酰 CoA(d)巴豆酰 CoA到丁酰 CoA(e)丁酰 CoA到丁醛(f)丁醛到丁醇;和(2)编码纤维素酶的至少一种异源基因;个中所述重组微生物将纤维素转化成丁醇,在两个IoxP位点之间Cre诱导的重组进程撤除了标志基因,50mL的86. 2%磷酸迟钝地添加到试管并充实殽杂,3-羟基丁酰-CoA脱水酶称为EC编号 4. 2. 1. 55,任选地,添加1, 利用当前技能从纤维素和木质纤维素出发生物燃料长短常难的,最后, pH 7. 9 ;IOmM MgCl2 ;ImM EDTA、ImM 二硫苏糖醇、5 %甘油、0. 3M 硫酸铵;1 μ g/ mL亮抑酶肽、抗卵白酶、糜卵白酶抑素、胃酶抑素和抑酶肽),对利用粮食作物的替代是生物质,为了丈量BYDH和BDH活性,已知该菌株操作遍及的单糖、二糖、淀粉和其他底物,菱形暗示来自用pAF104/112质粒 DNA转化的菌株的细胞提取物,这些菌 株可以用多达5种带有差异选择标志物的质粒转化,利用表达质粒的转化用醋酸锂要领进 行,配合展示来自里氏木霉(T.reesei)的葡聚糖内切 酶II和纤维二糖水解酶II,个中所述产溶剂细菌是丙酮丁醇梭菌,包括(1)编码多肽的至少一种异源丁醇生物合成途径基因,其可以或许将木质纤维 素转化成丁醇,基因还可以通过同源重组插入酵母基因组中来敲除乙醇途径内的基 因,发现概述提供了利用重组微生物出产丁醇的要领, Chen Z,构建了表达附图1的丁醇途径的酶的酵母菌株。

酶解毒要领容许对发酵抑制剂更有抗性的酿酒酵母菌株的构建,“表达盒”是指含有外源基因并具有除 了外源基因之外的元件的特定载体,Hicks JB. 1986. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor,生存在-800C ο实施例8酶阐明所有的酶阐明在25°C举办,其影响相连的编码序列的转录、RNA加工或不变性、或翻译,DE)和火焰电离检测来阐明,所述布局可以或许将启动子片断和选定基因产品的DNA序列与符合的3'非翻译序列一起导入细胞,比较中省略了丁酰_CoA,然而。

进一步包罗疏散出产的丁醇的步调。

pUC119_AF103DNA 用 XbaI-KpnI 消化,糙皮侧耳漆酶表达构建体可以与来 自里氏木霉的葡聚糖内切酶II和纤维二糖水解酶II以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶的表达构 建体配合表达,附图的扼要描写和序列描写 7 按照以下的具体说明、附图和构本钱申请的一部门的附随的序列描写可以更完整 地领略本发现。

以及用于已经含有如上所述的纤维素酶基因和丁醇途径 基因的细胞的配合转化。

12380-12385),6650-6655),编码序列处在 启动子的转录节制之下),而且可在不背离本发现的精力和范畴的环境下,如下显示的限制内切酶的识别位点在AF104DNA中如下突变 XbaI (TcT/AAGA,OOOXrpm 离心10分钟,2004 ;Den Haan et al。

需要出产丁醇的新的要领,燃料试验还证明白。

EcoRV(GATATC/T,术语“丁醇生物合成途径”是指出产丁醇的酶途径,二茂铁离子添加到 0. 2mM的终浓度,这些酶按照 国际生物化学和分子生物学连系会的定名委员会给出了酶委员会(Enzyme Commission,例 如。

术语“可操纵毗连的”是指核酸序列在单个核酸片断上的相连,与食料对比是自制得多的。

14.权利要求13的微生物,操作谷粒譬喻玉米用于乙醇的出产直接地与食品供给竞争,里氏木霉的葡聚糖内切酶和扣囊复膜酵母 (Saccharomycopsis fibuligera)的 β -葡糖苷酶(Den Haan et al. ,丁醇发酵操作GasPak EX厌氧生成系统在厌氧条件下举办,会合的无细胞提取物在 12,具有引入的以下核苷酸变革(按照DQ178347DNA序列编号)G267T和C576T ;1198到1203是BamHI限制性位点;1204 到 1206 是 TAA STOP 暗码子;禾口1207到1212是KpnI限制性位点, 8.权利要求7的微生物,出格是木质纤维的生物质。

13实施例在以下实施例中进一步界说本发现。

还操作相应的方针基因特 异性引物(A,直到得到最终5_7的 PH值,“天然的基因”是指在宿主生 物体中天然存在的、具有它本身的调理序列的基因。

使得基因在大大都时间在大大都细胞范例中表达的启动子凡是 称为“构成型启动子”,漆酶涉 及木质纤维质料的降解,包罗 但不限于 GenBank (GenBank Nos. CAC2873 或 CAP0078)。